超大孔填料在病毒样颗粒（VLP）疫苗纯化中的应用

VLP作为一个更具前景的载体工具，被广泛应用于基因治疗、疫苗研发和诊断等领域。相对于传统疫苗，VLP疫苗的安全性更高、免疫效果更好。在VLP疫苗的大规模生产中，下游层析工艺对最终产品的稳定性、安全性及有效性起到至关重要的作用。

VLP的特别之处

VLP（Virus Like Particle），病毒样颗粒，来源于病毒的外层衣壳蛋白，由一种或者多种衣壳蛋白组分自动组装形成的纳米级别的微小颗粒。VLP颗粒由病毒衣壳蛋白自组装而成，不含有病毒基因组，此特殊的空间结构能强烈地刺激人体的免疫系统，有效地诱导人体产生免疫保护反应。其优势如下：

• 安全性高：VLP不含复制酶和编码病毒结构蛋白的核酸，缺乏复制能力，不会传染，安全性有保障；

• 免疫效果好：VLP作为大小在40 - 200nm的抗原，可迅速排入淋巴结（LNs），并与抗原提呈细胞（APCs）和B细胞相互作用，有效刺激B细胞和T细胞反应。

• 表达系统多样性：大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物等多种表达体系可用于表达VLP。

• 技术成熟，已经商业化：据文献资料显示，目前已上市的基于VLP病毒样颗粒的疫苗有包括2价、4价、9价的人乳头瘤病毒（HPV）疫苗、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗以及疟疾疫苗。更多基于VLP的候选疫苗正在进行临床前和临床试验。

VLP的包膜结构

VLP主要分为eVLP和非包膜VLP，两者最大的区别就是在蛋白质衣壳外是否有一层包膜。

非包膜VLP：由单个或多个衣壳蛋白组成的结构相对简单的 VLP，可以在原核和低级真核系统中表达，例如：戊肝病毒、HPV病毒、手足口病毒。

包膜VLP（eVLP）：以矩阵形式包裹在来源于宿主的含有糖蛋白的脂膜中，结构复杂，构建难度大，但可设计性更强。通常在真核表达系统表达，需要共表达几种结构蛋白用于细胞内的自组装过程。例如：乙肝病毒、流感病毒、冠状病毒。

VLP疫苗纯化中的挑战

VLP疫苗尽管优势明显，市场潜力巨大，但是目前仍然存在某些方面的局限及困难，尤其是产品纯化方面，VLP 的宿主细胞衍生膜能够整合抗原和佐剂，与此同时，也存在多种与工艺相关的宿主细胞杂质，产品收率低（特别是包膜VLP），加上缩短上市时间及高昂的开发成本等压力，都在一定程度上导致了工艺开发的不足，为下游工艺开发带来了极大的挑战。

目前市场上已有的纯化工艺，大都采用普通的层析介质，或多或少都有一定的局限性。

与其他生物分子相比，VLP病毒颗粒最大的特点在于其多聚亚基的大颗粒结构，且分子尺寸较大（直径20~800nm），普通的琼脂糖微球和聚合物微球孔径较小，病毒颗粒不能有效的进入微球内部而导致结合载量及其低，同时狭窄的孔径会导致其以扩散的方式通过，传至速度慢，处理量低，耗时长，且会破坏病毒颗粒的结构使其解聚，活性降低，从而影响回收率。

科诺赛经过充分的市场调研，聚焦VLP纯化中的难点，结合自有的超大孔色谱分离技术（孔径大于200nm），提出了VLP纯化的解决方案，并成功地实践应用，为客户解决了问题。

VLP疫苗纯化推荐方案

纯化策略的主线 - 澄清、捕获、纯化和精纯。 

在收获和裂解细胞后，为了确保去除污染的细胞碎片和聚集体，需要进行澄清。为了获得完整和更纯净的VLP，需要再进一步分离纯化。

病毒样颗粒 VLP的下游纯化工艺因表达体系的不同，存在不同的纯化策略，其中Crysto Shell 700 / 400复合模式层析填料和MoSphere 50V Q / DEAE超大孔层析介质，因其独特的结构特点在 VLP 纯化工艺开发中占据优势地位。
VLP粒径较大，优先考虑Crysto Shell 700，VLP粒径较小，优先考虑Crysto shell 400，具体需要根据试验结果平衡收率和纯度来综合考虑。
而在精纯步骤，由于病毒颗粒较大，MoSphere 50V Q / DEAE超大孔层析介质，是最佳选择。

VLP纯化 方案一

第①步 复合模式层析纯化：

使用Crysto Shell 700 / 400（阴离子交换与疏水双重功能）复合模式层析介质，吸附宿主细胞杂质，VLP分子量大，排阻在外直接流穿，此步骤可以去除 85% 的宿主蛋白。

PS：Crysto Shell 相比 Capto Core 孔径更小，可确保回收率。

第②步 离子交换层析纯化：

使用MoSphere 50V Q / DEAE超大孔阴离子交换层析介质，进行精纯。

VLP纯化 方案二

第①步 复合模式层析纯化：

使用AdMix Chromrose FF（阴离子交换与疏水双重功能）复合模式层析介质，吸附宿主细胞杂质，VLP分子大，排阻在外直接流穿，此步骤可以去除 80% 的宿主蛋白。（VLP粒径＞80nm适用）

第②步 离子交换层析纯化：

使用MoSphere 50V Q / DEAE超大孔阴离子交换层析介质，进行精纯。
PS：此方案较【方案一】成本更低，可作为节省成本的替代方案。

包膜VLP纯化应用案例 

项目背景： 客户样品为有包膜的病毒抗原VLP疫苗，筛选了市场上多家填料均无法满足要求，只有某进口品牌的强阴离子介质能够满足其结合要求，没有流穿，但载量较低。 客户更换为科诺赛超大孔离子交换介质后，在高盐的情况下，不仅结合性好，载量也有所提升，完全能够实现填料国产化替代。

科诺赛产品：MoSphere 50V Q  超大孔阴离子交换介质

项目进展：中试 。

测试结果：

采用科诺赛 MoSphere 50V Q 超大孔离子交换介质，在高盐条件下上样，没有流穿出现。
VLP疫苗纯化的方案不止以上这几种，来自同一家族病毒的VLP可能具有复杂的表面特性。例如，不同毒株的流感VLP在表面抗原上有差异，这就需要因地制宜地调整纯化策略。

总的来说，科诺赛的MoSphere 50 系列超大孔层析填料，在病毒颗粒（VLP）疫苗下游分离纯化工艺中是必不可少的、最有效的分离载体之一。

匹配市场需求的产品才有价值

科诺赛的超大孔填料，已经被广泛应用于病毒、VLP、AAV载体、质粒、外泌体、mRNA及超大蛋白分子的分离纯化中，并且充分显示出了其在纯化方面的优越性，成功了帮助客户解决了一个个纯化难题，切实地帮助客户实现降本增效。