实验中镍亲和层析影响因素之六聚组氨酸

目的研究六聚组氨酸在重组蛋白中的位置对镍亲和层析的影响。方法采用PCR法扩增目的基因,克隆人pMD18-T载体后进行序列测定。构建原核表达载体pET28-His-Cpn10-IL4与pET28-Cpn10-His-IL-4,在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达两种在不同位置带有六聚组氨酸(His-tag)的重组白细胞介素4(rhIL-4)融合蛋白。用SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达产物,采用镍亲和层析的方法纯化两种重组融合蛋白。结果Western印迹证实两种融合蛋白均可与抗组氨酸单克隆抗体特异性结合,但用镍亲和层析方法可以很好地分离纯化融合蛋白His-Cpn10-IL-4,却不能纯化融合蛋白Cpn10-His-IL-4。结论应用镍亲和层析的方法纯化融合蛋白时,His-tag在融合蛋白中的位置对蛋白质的纯化非常重要,His-tag可以在融合蛋白的N端和C端,但不能在中间。
以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0μmol/mL,最终N i2+配基密度达到了30.9μmol/mL,偶联效率为81.3%。利用得到的镍离子亲和介质对基因工程大肠杆菌表达的组氨酸标记3-羟基丁酮还原酶进行了一步层析纯化,酶活回收率达到了58.8%,纯化倍数为2.1,蛋白纯度在85%左右,纯化效果与常用商品介质基本相当。
青岛科诺赛生物科技有限公司专注于生物分子分离纯化，业务有蛋白A亲和层析,疏水层析，镍亲和，肝素亲和，抗体/疫苗/重组蛋白纯化等，现拥有研发及中试实验室2000平方米，生产基地23000余平方米