常用的抗体纯化方法

抗体纯化方法的选择一般取决于抗体的来源、时间的需求、成本的预算以及抗体的最终用途等。本篇文章介绍了以色谱纯化法为主的四大纯化方法，包括了亲和层析法、离子交换层析法、尺寸排阻色谱法和疏水作用色谱法。

一．亲和层析法

亲和纯化是一种具有可逆反应的生化分离纯化技术，如抗原与抗体。适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。如图1所示，琼脂糖首先与介质偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质，再加入成分复杂的混合物也就是样品，配体选择性吸附生物活性物质 (高亲和力抗体)，平衡液清洗杂质，最终洗脱获得目标抗体。

图1.亲和层析示意图

Protein A，Protein G与Protein A/G抗体纯化法

20世纪70年代初期，细菌蛋白开始作为纯化免疫球蛋白的方法出现。细菌蛋白对抗体的高亲和力使其成为用于检测和纯化抗体一种强有力的工具。其中，金黄色葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A) 和链状球菌蛋白G (streptococcal protein G) 是最为常见的两种用于纯化全长抗体的配体，它们能够与不同物种或不同亲和力的抗体结合。

金黄色葡萄球菌蛋白A，简称protein A，来源于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌表面。天然的protein A含有5个同源免疫球蛋白 (大多数为IgG) 结合域（E, D, A, B和C）可以与抗体的Fc区特异性结合 (CH2与CH3之间)。此外，protein A也可结合抗体重链可变区的CDR2与CDR3之间。Protein A的分子大小约为42kDa，对于大部分物种的IgG都具有较高的亲和力。研究表明，一个protein A分子可以同时结合至少2个IgG分子。天然protein A作为配体被偶联在琼脂糖介质上，这样它的结合域便可用来捕捉和结合IgG。虽然天然protein A与IgG的亲和力很强，但它会和非目的蛋白结合，则最终会导致蛋白的纯度下降，因此达不到标准。于是，重组protein A在基于天然protein A的基础上进行了一定程度的基因工程技术改造，但这并不影响重组protein A对于免疫球蛋白Fc区的特异性，在增强其抗体的结合能力同时，纯化效果也得到了显著地提高。

图2. Protein A结构

链状球菌蛋白G，简称protein G，是一种来自链状球菌的细胞壁蛋白。分子量约为25kDa。由三个白蛋白结合域 (ABD1, ABD2, ABD3) 和免疫球蛋白结合域构成。与protein A相似，protein G可与IgG的Fc区特异性结合，但是protein G能够特异性结合的抗体种类更加广泛，对于非常见物种IgG的结合能力也比较好，血清蛋白结合水平更低，纯度也更高。重组protein G使用基因重组技术经E.coli发酵生产的重组链状球菌蛋白，人工除去了白蛋白结合域和细胞表面结合域，以减少非特异性结合，因此，它比天然protein G和protein A有更强大的亲和力。

图3. Protein G结构

总的来说，protein A和protein G各具特点。经过改造的重组protein A与琼脂糖介质的多位点结合保证其耐受力，因而可以在恶劣洗脱条件下最高程度地保持配体不脱落。Protein G能够结合大多数哺乳动物的IgG，并且具有更高的亲和力 (其中人源和鼠源的抗体最为显著) 但却不能像protein A一样可以经受住严苛的洗脱条件。

Protein A/G是一种基因工程结合蛋白，通过基因工程方法将protein A与protein G分子中与IgG的Fc区结合域的基因融合，表达为融合蛋白。它由4个protein A和2个protein G免疫球蛋白结合域组成，分子量大约为40-50 kDa，比单独的protein A或protein G结合范围更加广泛，并将其优点融为一体，几乎可以应用于所有种属的IgG纯化

抗原亲和纯化法

利用抗原为配体的亲和纯化被称之为抗原亲和纯化，是一种高度纯化蛋白类生物大分子的有效手段。使用这种方法，抗原将替代亲和配体，被化学偶联在凝胶介质上。为了建立亲和层析，需要大量的纯化抗原，由于抗原非常特殊，这意味着可能需要自己合成或纯化抗原，同时也要注意确保获得抗原性。目标抗体将特异性结合抗原，最终洗脱获得目标抗体。

抗原亲和纯化法与Protein A纯化法最大区别在于，前者是与抗体的Fv区特异性结合，后者则是与抗体的Fc区特异性结合。相较之下，抗原亲和纯化能够高度识别和结合目标抗体，因此也多用于从多克隆抗体中纯化抗原特异性的抗体。

图4. 抗体亲和纯化柱原理示意图

固定化金属螯合亲和层析法

固定化金属螯合亲和层析通过螯合固定的金属离子与蛋白质之间的亲和作用，分离并纯化蛋白质。琼脂糖作固定相偶联螯合剂亚氨基二乙酸，亚氨基二乙酸的钠盐与金属离子螯合后，过渡金属离子(Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+)将与蛋白质表面的一些氨基酸(组氨酸、色氨酸或半胱氨酸)配位结合，不同的蛋白质与金属离子的结合力不同，从而达到将蛋白质分离的目的。

它与其他的亲和纯化技术相比，配体稳定性高，吸附量大，洗脱条件温和，但同样也更加复杂，因为需要额外的步骤固定金属离子。不同的金属离子都可以螯合到柱上，如此相同的吸附剂对于不同的金属离子就能产生不同的吸附性选择。因此，选择合适的金属离子种类对获得最佳的分离效果也是至关重要的。

附加表位作为抗原决定簇更为人所知。然而，poly-His (HHHHHH)，C-myc (EQKLISEEDL)，FLAG (DYKDDDDK)，血凝素 (YPYDVPDYA)，T7 (MASMTGGQQMG) 和Glu-Glu (EYMPME) 等短氨基酸序列也可以用于重组抗体的纯化。这些短序列通过PCR(聚合酶链式反应)的方式被添加在抗体序列的末端。Poly-His无疑是用于纯化重组抗体的最普遍使用的亲和标签。组氨酸与过渡金属离子形成复合物，结合是pH依赖性的，这可以用于基于IMAC纯化的His-标记蛋白质的洗脱。尽管在E.coli中基于poly-His-标签蛋白质的纯化可以产生高达90%纯度的蛋白质，但昆虫和哺乳动物细胞中较高百分比的组氨酸残基可导致背景污染物的明显增加。由于它们较小的尺寸，比起其他较大的对应物具有较少的空间位阻，因此表位亲和标签可以更有利于蛋白质纯化。

二．离子交换层析法

离子交换层析是一种较为常见并被广泛使用的抗体纯化方法。带有电荷的溶质分子，可与带有相反电荷的固定化离子交换基团之间发生可逆的相互作用。

抗体是蛋白质，由两性物质氨基酸组成，其中包括了一些具有酸性或碱性功能的侧链，能够在一定的pH缓冲液中电离为离子。等电点pI一般作为离子交换层析实验条件选择的标准。通常根据离子交换固定相的性质分为阴离子交换层析与阳离子交换层析两种。抗体在低于其等电点的pH环境时，以碱性离解为主，呈阳离子状态，带有正电荷，可与阳离子交换剂结合。相对的，抗体在高于其等电点pH环境时，以酸性离解为主，呈阴离子状态，带有负电荷，可与阴离子交换剂结合。被分离物质对固定化离子交换基团的亲和力不同，因此可以通过改变缓冲液的离子强度与pH值，从而达到分离抗体的目的。

图5. 阴阳离子交换示意图

三．尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法可用于DNA，蛋白质的纯化，缓冲液更改，脱盐等。它是一种温和的分离方法，尺寸排阻的分离原理取决于分子在溶液中的体积。当溶液加入纯化柱时，分子会依照其在溶液中的尺寸(分子平均直径)从大至小依次分离。分子小的通过柱床流动速度相对缓慢，因为它们会不同程度的深入孔隙，而大的分子由于不能进入柱床而被快速排出。因此，通过分子体积大小洗脱样品，可以有效地进行分选。

尺寸排阻色谱一般可分为两种类型，凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱，分别以有机溶剂和水为流动相。凝胶渗透色谱使用疏水柱填充材料和非水性流动相来测量合成聚合物的分子量分布；凝胶过滤色谱则使用亲水包装材料和水性流动相来分离，分馏或测量可溶于水的分子的分子量分布。总的来说，尺寸排阻可以去除低分子量污染物，但由于其低生产率，这种方法并不适用于纯化抗体的大批量生产，但它仍是小规模纯化IgM，去除IgG与IgM中聚集体，和分析它们的可靠选择。

图6. 尺寸排阻色谱柱

四．疏水作用层析法

疏水作用层析法是利用盐-水体系中样品分子的疏水基团和层析介质的疏水配基之间疏水力的不同而进行分离的一种层析方法。这种方法利用被分离组分分子表面的疏水微区，变形后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。

单克隆抗体由于其分子中有许多非极性氨基酸，暴露于抗体分子表面的非极性氨基酸侧链可以密集在一起形成疏水区，起到稳定抗体的三，四级结构的作用。不同单抗疏水区的强弱有着较大的差异。溶液盐浓度增加，疏水作用将变得更强，因此，大多数疏水作用层析都是在高盐浓度条件下上样，低盐浓度进行洗脱。疏水作用介质的重要特点是疏水性弱，与蛋白质的作用比较温和，所以能够更好地保持生物大分子的天然结构和生物活性，同时疏水作用也非常擅长从大体积样品中提取低含量的目标蛋白。