亲和层析法分离纯化动物腹水中抗体的实验方法

时间:2022-03-08 15:00:02 点击数:

基本原理: protein A和proteiin G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A Chromrose TM4FF和Protein G ChromroseTM 4FF是专业偶联耐碱重组Protein A和Protein G的高流速琼脂糖层析介质,当动物腹水从层析柱中流过时,特异性的IgG就与层析介质中的配基结合,其他杂蛋白则穿流而过。

因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同,我们需要具体情况具体对待,分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a,IgG2b,IgG3,兔,人,猪的多克隆抗体用protein A纯化,而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗,小鼠,大鼠,山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。

物种

亚类

Protein A 结合

Protein G 结合

Protein L 结合

lgG(常规)

+++++

++++

++++

lgG1

+++++

++++

++++

lgG2

+++++

++++

++++

lgG3

-

++++

++++

lgG4

++++

++++

++++

lgM

-

-

++++

lgA

-

-

++++

lgE

-

-

++++

lgD

-

-

++++

Fab

++

++

++++

κ轻链

-

-

++++

L轻链

-

-

-

ScFv

++

-

++++

鸡蛋黄

lgY

-

-

-

IgG

-

+

++

lgG

++

++++

-

lgG

++++

++++

+

山羊

lgG

+/-

++

-

豚鼠

lgG1

+++

++

++

lgG2

+++

++

++

仓鼠

lgG 

+

++

+++

lgG

+

++

++++

考拉

lgG 

-

+

+

骆驼


-

+

+

猴(恒河)

 lgG

++++

++++

++++

小鼠

lgG1

+

++++

++++

lgG2a

++++

++++

++++

lgG2b

+++

+++

++++

lgG3

++

+++

++++

lgM

可变

-

++++

IgG

++

++++

+/-

IgG

++++

+++

+

大鼠

lgG1

-

+

++++

lgG2a

-

++++

++++

lgG2b

-

++

++++

lgG2c

+

++

++++

绵羊

lgG 

+/-

++

-

lgG

++++

-

N/A

 

具体实验步骤如下:

1. 根据要纯化的抗体量选择适当的层析柱,推荐使用HiQumnTM CTN30型中高压层析柱(内径10mm)或者HiQumnTM CXK10型层析柱(内径16mm)或者更大的层析柱

2. 将计算过合适体积的Protein A Chromrose TM4FF或Protein G ChromroseTM 层析介质填装到HiQumnTM 层析柱中,接入层析系统进行加压,待流动相流过3个柱体积后,将HiQumnTM 层析柱柱头调节杆调整到层析介质下方2-3mm处固定

3. 通过层析系统泵入要纯化的经预处理了的动物腹水一个柱体积,流动相为结合液。建议流速CV/5min;

5. 用5倍柱体积的结合液平衡柱子;

5. 用5-10倍柱体积的缓冲液清洗层析柱,直到没有样本流出;

6. 用5-10倍柱体积洗脱液洗脱层析柱,并收集抗体;

7. 将所纯化的抗体加入30%-50%的甘油置于-20摄氏度或者-80摄氏度即可长期保存。


图片2.jpg

 

图1. 科诺赛HiQumn CTN30-10层析柱

图片1.jpg

 

图2. 科诺赛Protein A Chromrose 亲和层析介质

111

222

311





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