青岛肝素亲和层析介质操作步骤

     肝素亲和层析介质广泛用于抗凝血因子III、凝血酶、类凝血酶、人凝血因子IX、XI和VIII等生物大分子的分离纯化。层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。

1.平衡：用5~10CV的平衡缓冲液（20-50mM PB或Tris/HCl，pH 7.4-8.0，可加入0.15M NaCl抑制非特异吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。

2.进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

3.淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

4.洗脱：用洗脱缓冲液（20-50mM PB或Tris/HCl+1-2M NaCl，pH7.4-8.0，NaCl浓度需要根据目标蛋白的结合力进行适当调整）洗脱，收集流出液。可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱。

5.原位清洗：为了避免不同样品间的相互干扰，或者当介质污染比较严重时（反压增加），需要对介质进行在位清洗。

（1）对于以离子键结合的蛋白，可用2~3 CV以上的2M NaCl清洗，并用3 CV以上的纯水冲洗。 （2）对沉淀或变性蛋白蛋白，可用0.1M NaOH清洗（1~2h），并用3~10 CV平衡液和3 CV以上的纯水冲洗。也可用6M Gua-HCl或8M Urea清洗（0.5~1h） （3）对疏水性结合的蛋白，可用0.1~0.5%的非离子去污剂清洗（1~2h），并用3~10 CV的纯水冲洗。

其它注意事项：在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。